C’est en tant que lieutenant du sieur Isaac de Razilly, son cousin, que d’Aulnay joint les rangs de la marine et arrive en Acadie en 1632. Suite à la mort du sieur de Razilly en 1636, d’Aulnay va s’établir à Port-Royal qu’il obtient en seigneurie et deviendra lieutenant-gouverneur de l’Acadie en 1638. Bien qu’il soit davantage célèbre pour ses nombreuses disputes avec son rival, le sieur Charles de Saint-Étienne de La Tour, d’Aulnay est un promoteur tenace de l’Acadie, aux prises pendant quinze ans avec la délicate question de la colonisation.

Les rivalités intestines de la colonie lui causent de nombreuses difficultés. En effet, le sieur de La Tour, qui administre les établissements du Cap-Sable et de la rivière Saint-Jean, revendique également le gouvernement de l’Acadie et leur rivalité ne prendra fin qu'à l'issue de la victoire militaire du sieur d'Aulnay lorsqu’il capture le fort du sieur de La Tour à l’embouchure de la rivière Saint-Jean en 1645. En 1647, la couronne française nommera le sieur d’Aulnay gouverneur de l’Acadie.