En 1604, Jean de Biencourt, sieur de Poutrincourt, s’associe au sieur de Mons dans son expédition vers l'Acadie. En plus de jouer un rôle important quant au maintien et à l'autonomie de la jeune colonie, c'est à lui que revient la charge d'y emmener les soldats et les armes nécessaires à sa défense.

Après avoir visité le futur emplacement de Port-Royal, endroit qui lui paraît enchanteur, le sieur de Poutrincourt demande à de Mons de lui en céder la concession. Dès l'automne 1604, il retourne en France pour faire confirmer cette concession par le roi, en plus de rapporter avec lui une cargaison de pelleteries. En 1605, Poutrincourt effectue un bref retour en Acadie pour ravitailler la colonie de l'Île Sainte-Croix. L'année suivante, c'est en tant que lieutenant-gouverneur de l'Acadie qu'il revient en Nouvelle-France, en remplacement du sieur de Mons qui était rentré en France pour protéger ses intérêts commerciaux. Poutrincourt conservera ce titre jusqu’en 1607, suite à la révocation du monopole du sieur de Mons par le roi Henri IV.

Poutrincourt, qui cherche un moyen de revenir à Port-Royal, insiste à la cour sur les succès de la conversion des Amérindiens à la foi catholique et réussit ainsi à organiser une nouvelle expédition pour 1610. Il amène entre autres avec lui les Saint-Étienne de La Tour, père et fils, Thomas Robin, qui aide à financer l'expédition, et un prêtre, l'abbé Jessé Fléché. Poutrincourt doit cependant rapidement rentrer en France pour administrer ses affaires. Il donne donc à son fils, Charles de Biencourt, la charge de la jeune colonie. Ce dernier s'en acquittera jusqu'en 1613, date à laquelle elle est détruite sous le feu des troupes de Samuel Argall.